紫外分光光度計UV1901PC上海奧析科學儀器有限公司測酶激肽釋放酶原激活劑測定法
本法系采用顯色底物法(或顯色基質法)測定供試品中激
肽釋放酶原激活劑(P KA )含量。
試劑 (1) 0. 0 5m o l/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-
HC1)緩沖液(含0. 15mol/L氯化鈉溶液,簡稱TNB) 稱取
6 .06g三羥甲基氨基甲烷(T ris,分子量為121.14)及8. 77g
氯化鈉,加適量水溶解后,用lm o l/L鹽酸調p H 值至8 .0,
補加水至1000mlD
(2)2m m ol/L激肽釋放酶顯色底物(S~2302)溶液稱取
S-2302 12. 5mg, 加 10ml 水溶解。
(3 )前激肽釋放酶(P K ) 采用適宜方法提純P K , 小體
積分裝,_3(TC以下保存?zhèn)溆谩?/span>
PKA標準品溶液的制備取P K A 標準品適量,用
0. 85%氣化鈉溶液分別稀釋成每lm l中含10. OIU. 20. 0 IU、
30.0IU、40.0IU、5 0 .0 IU的溶液。按每次用量,小體積分
裝,一3 0 t;保存?zhèn)溆谩S们叭诨▋H允許凍融1 次),并用
TN B稀釋10倍。
供試品溶液的制備取供試品適量,用T N B 稀釋
10倍。
測定法取供試品溶液20^1,加至9 6孔微量滴定板孔
內,加PK 20.50^1,同時開動秒表計時,向每孔加P K 的
時間間隔應相同,將微孔滴定板振蕩1分鐘;加蓋,于25.
30t;放置30分鐘后,按加P K 的順序和時間間隔向各反應
孔加2mmol/L S-2302溶液2 0 j J ,振蕩1 分鐘;加蓋,于
25.30aC放置1 5分鐘后,再以同樣的加液順序和時間間隔
加50%醋酸溶液2 0 f J ,振蕩1 分鐘后,照紫外-可見分光光
度法(通則0401),在波長405nm處測定吸光度;同時以
TNB20.50F1代替PK 20.50卜1,同法操作,作為空白對
照,用P K A 標準品溶液的2 (^1替代供試品溶液,同法操
作。以P K A 標準品溶液的P K A活性的對數(shù)對其相應的吸
光度對數(shù)作直線回歸,求得直線回歸方程,計算出供試品
P K A 活性。
【附注】(1 )每個P K A標準品溶液和供試品溶液做3孔,
其中2 個為測定孔、1 個為對照孔,2 個測定孔吸光度差值
應小于0. 020。
(2 )每次測定可根據(jù)供試品P K A含量,適當調整PKA
標準品溶液的范圍。
(3 )線性回歸的相關系數(shù)應不低于0. 99。
(4 )加PK、士2302及50%醋酸溶液時,各孔的間隔時
間應相同,加液的順序要一致,盡可能使各孔處于同一反應
條件下。
(5 )加P K和加S~2302溶液后的放置時間系從*孔加
液時算起。
(6 )如放置溫度低于251C, 應分別在兩次反應過程的限
定時間內于3 7 t:放置10分鐘。
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